自噬是宿主防御病毒感染的重要生物學(xué)過(guò)程，然而許多病毒進(jìn)化出了各種策略來(lái)破壞宿主的抗病毒系統。一些其他病毒誘導自噬，然后劫持自噬體并將其用作復制位點(diǎn)，或劫持分泌性自噬途徑以促進(jìn)病毒顆粒的成熟和排出，從而增加復制。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）以其狡猾的免疫逃逸策略，給全球養豬業(yè)帶來(lái)了前所未有的挑戰。這種病毒不僅能夠引發(fā)豬只的嚴重疾病，更通過(guò)精妙的機制操縱宿主的自噬過(guò)程，來(lái)增強其生存和復制能力。目前，關(guān)于PRRSV在自噬過(guò)程中的逃逸機制，特別是通過(guò)分子伴侶介導的自噬（CMA）的研究有限。
IF：5.1 中科院1區 | JCR/Q1 生物學(xué) 參考譯文：PRRSV GP5 通過(guò)靶向 LAMP2A 抑制分子伴侶介導的自噬的抗病毒作用 第一作者：Wen Li 通訊作者：夏平安，張宜娜，陳靜 |
I 主要研究結果 |
圖1. PRRSV 感染誘導不完全自噬
2. GP5是PRRSV誘導自噬的主要調節因子
為了研究PRRSV如何導致感染細胞自噬活性發(fā)生這種劇烈變化，探索了負責阻斷自噬的病毒蛋白。用表達GP3、GP4、GP5、M或N的載體轉染HEK293T或MARC-145細胞，檢查了內源性L(fǎng)C3 I向LC3 II的轉化以及SQSTM1的積累。結果表明，GP5的過(guò)表達顯著(zhù)促進(jìn)了LC3-II的形成并增加了SQSTM1的蛋白質(zhì)水平。GP5可能導致RFP和GFP雙陽(yáng)性囊泡（黃色斑點(diǎn)）的積累，表明自噬體和溶酶體的融合被阻斷。此外，GP5明顯降低了LC3和LAMP2A的共定位。這些結果表明GP5是PRRSV誘導的自噬的主要抑制劑。然而，GP5對LAMP2A的結合親和力可能比LC3更大。因此，推測GP5介導的自噬抑制可能主要與溶酶體有關(guān)。
圖2. GP5 是 PRRSV 誘導自噬的主要調節劑
3. GP5 與 CMA 關(guān)鍵蛋白 HSC70 和 LAMP2A 相互作用
通過(guò)共免疫沉淀（co-IP）結合液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)在PAMs細胞中鑒定了與GP5相互作用的蛋白質(zhì)。實(shí)驗結果顯示HSC70和LAMP2A是與GP5相互作用的蛋白。進(jìn)一步的實(shí)驗驗證了GP5與HSC70和LAMP2A的相互作用，并發(fā)現GP5能夠與HSC70競爭性結合LAMP2A，從而破壞LAMP2A-HSC70復合體的形成。
此外，盡管GP5含有類(lèi)似CMA（分子伴侶介導的自噬）基序的五肽序列“QKFDW”，但研究表明GP5并非CMA的底物。通過(guò)構建GP5突變體并進(jìn)行實(shí)驗，研究人員發(fā)現即使在突變體中，GP5仍然能夠與HSC70相互作用，并且HSC70促進(jìn)了GP5的表達而非降解。這表明GP5與HSC70的相互作用區域并非GP5上的“QKFDW”序列。
最后，通過(guò)預測GP5的結構域并構建突變體，研究人員確定了GP5的N端66-88和126-201氨基酸區域是與HSC70相互作用的關(guān)鍵區域。這些發(fā)現為理解GP5如何通過(guò)靶向LAMP2A抑制CMA提供了重要信息，并且揭示了PRRSV逃避宿主細胞自噬機制的新策略。
圖3.GP5 通過(guò)競爭性結合 LAMP2A 來(lái)破壞 LAMP2A 和 HSC70 之間的相互作用
4. GP5 通過(guò)抑制 MTORC2/PHLPP1/GFAP 通路降低 CMA 活性
由于GP5不是CMA的底物，但能與LAMP2A競爭性結合，研究者推測GP5可能通過(guò)與LAMP2A的相互作用來(lái)調控CMA的活性。實(shí)驗結果顯示，GP5過(guò)表達或PRRSV感染的細胞中，關(guān)鍵CMA蛋白PHLPP1、GFAP和LAMP2A的水平下降，同時(shí)GFAP的磷酸化水平上升，表明GP5通過(guò)抑制MTORC2/PHLPP1/GFAP信號通路來(lái)降低CMA活性。
為了評估CMA活性，研究者使用了一種光轉換的人工CMA報告分子KFERQ-PA-mCherry，該分子在405納米可見(jiàn)光照射下會(huì )由非熒光變?yōu)榧t色熒光，使溶酶體呈現紅色熒光斑點(diǎn)。紅色斑點(diǎn)的數量是CMA活性的可靠指標。實(shí)驗觀(guān)察到，GP5過(guò)表達或PRRSV感染的MARC-145細胞中紅色熒光斑點(diǎn)數量減少，這進(jìn)一步證實(shí)了PRRSV通過(guò)GP5降低了CMA的活性。
圖4.GP5 降低 CMA 的活性
5.GP5 通過(guò)解離未修飾的 GFAP-LAMP2A 復合物來(lái)加速 LAMP2A 的分解
研究發(fā)現GP5能夠上調GFAP的磷酸化并下調LAMP2A的表達，這可能是GP5破壞CMA的一個(gè)重要因素。通過(guò)共免疫沉淀和間接免疫熒光實(shí)驗，觀(guān)察到GP5與EF1α而非GFAP相互作用。此外，GP5在存在時(shí)減少了LAMP2A與去磷酸化突變體GFAP (S8A)的相互作用，并破壞了GFAP (S8D)與EF1α的結合。這些結果表明GP5促進(jìn)了pGFAP-EF1α復合體的解聚，導致未修飾的GFAP從多聚體LAMP2A上解離，從而瓦解LAMP2A，降低了CMA的活性。
進(jìn)一步的實(shí)驗評估了GFAP對PRRSV復制的影響，結果顯示GFAP (S8D)降低了LAMP2A的表達，增加了細胞裂解液中的PRRSV N蛋白水平和病毒基因組拷貝數，以及培養上清中的病毒產(chǎn)量。相反，GFAP (S8A)能夠維持LAMP2A的穩定性，減少PRRSV N蛋白水平、病毒基因組拷貝數和病毒產(chǎn)量。因此，研究推測CMA活性的變化可能會(huì )影響PRRSV的增殖。
圖5. GP5 解離未修飾的 GFAP-LAMP2A 復合物
6.GP5 通過(guò)阻斷 K63 連接的多泛素化來(lái)?yè)p害 LAMP2A 的穩定性
研究發(fā)現，隨著(zhù)GP5劑量的增加，LAMP2A蛋白水平呈劑量依賴(lài)性下降，而LAMP2A的mRNA水平?jīng)]有顯著(zhù)變化，表明GP5可能通過(guò)降低LAMP2A的穩定性來(lái)促進(jìn)其降解。通過(guò)使用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑CQ的實(shí)驗，結果表明GP5通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)LAMP2A的降解，而非通過(guò)溶酶體途徑。特別是，GP5過(guò)度表達顯著(zhù)抑制了LAMP2A的K63連接的多聚泛素化，這表明GP5通過(guò)破壞LAMP2A的K63連接多聚泛素化來(lái)減弱其穩定性，從而促進(jìn)其降解。
圖6.GP5 通過(guò) UPS 削弱 LAMP2A 的蛋白質(zhì)穩定性
7.GP5 抑制 CMA 的抗病毒作用
研究發(fā)現，LAMP2A的過(guò)表達能夠降低PRRSV N蛋白水平、病毒基因組拷貝數，以及減少培養上清中的病毒產(chǎn)量。相反，通過(guò)siRNA技術(shù)敲低LAMP2A的表達則會(huì )增加PRRSV的復制。此外，利用饑餓（一種CMA激活劑）處理PRRSV感染的細胞，能夠減少病毒的復制，而使用NH4Cl和亮抑素（CMA抑制劑）則會(huì )增加病毒復制。
進(jìn)一步的實(shí)驗表明，GP5通過(guò)減少LAMP2A蛋白水平，增加PRRSV N蛋白水平和病毒基因組拷貝數，進(jìn)而提高病毒產(chǎn)量，從而抑制CMA的激活。為了理解CMA的抗病毒機制，研究人員使用西方印跡法篩選被CMA降解的PRRSV病毒蛋白，發(fā)現CMA激活能顯著(zhù)降低NSP11的表達。NSP11已知能減少干擾素-β的表達，并且抑制RIG-I的活性。通過(guò)雙重熒光素酶報告基因和西方印跡法的實(shí)驗，研究人員發(fā)現CMA激活能夠顯著(zhù)提高NSP11過(guò)表達細胞中IFN-β啟動(dòng)子的活性和RIG-I的表達，表明CMA激活能夠抵消NSP11介導的對IFN-I信號通路的抑制。這些發(fā)現表明GP5通過(guò)靶向LAMP2A抑制CMA的激活，增強了NSP11對RIG-I介導的IFN-I信號通路的抑制作用，從而促進(jìn)PRRSV的復制。
圖7.CMA 的激活可抑制 PRRSV 復制
| I 研究總結 |
GP5對CMA的抑制作用
研究結果表明，CMA活性的調節直接影響PRRSV的復制能力。當CMA活性被激活時(shí)，如通過(guò)饑餓處理，PRRSV的復制受到抑制；相反，當CMA活性被抑制時(shí)，例如使用NH4Cl和亮抑素處理，PRRSV的復制能力得到增強。此外，通過(guò)siRNA技術(shù)敲低LAMP2A的表達，也證實(shí)了CMA活性的降低會(huì )促進(jìn)PRRSV的復制。
最后，本研究揭示了GP5在PRRSV免疫逃逸中的作用機制。GP5不僅通過(guò)抑制CMA活性來(lái)促進(jìn)病毒復制，還通過(guò)影響NSP11介導的IFN-I信號通路來(lái)增強PRRSV的免疫抑制作用。這些發(fā)現為理解PRRSV如何在宿主細胞內建立感染和復制提供了新的視角，并為開(kāi)發(fā)新的抗病毒策略提供了潛在的分子靶點(diǎn)。
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00532-24
返回列表
