文章引用曲博士豬群健康管理公眾號，通過(guò)問(wèn)答的形式，和大家一起學(xué)習關(guān)于實(shí)驗室熒光定量PCR的基本知識。

⑴ RT-PCR是逆轉錄 PCR，是普通PCR的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行 DNA擴增。

⑵ Real-time PCR和 qPCR是一樣的，都是實(shí)時(shí)定量PCR，指的是PCR過(guò)程中每個(gè)循環(huán)都有數據的實(shí)時(shí)記錄，因此可以對起始模板數量進(jìn)行精確的分析。

⑶ Real-time PCR和 RT-PCR看起來(lái)都可以縮寫(xiě)為RT-PCR，但是國際上普遍認為RT-PCR特指反轉錄PCR，而Real-time PCR一般縮寫(xiě)為 qPCR。

⑷ Real-time RT-PCR（RT-qPCR）， 就是結合了熒光定量技術(shù)的反轉錄PCR：先從 RNA 反轉錄得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR進(jìn)行定量分析（qPCR）。

擴增曲線(xiàn)是指PCR過(guò)程中，以循環(huán)數為橫坐標，以反應過(guò)程中實(shí)時(shí)熒光強度為縱坐標所做的曲線(xiàn)。

基線(xiàn)是指在PCR擴增反應的最初數個(gè)循環(huán)里，熒光信號變化不大。接近一條直線(xiàn)，這樣的直線(xiàn)即是基線(xiàn)。

一般將 PCR反應前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR 3~15個(gè)循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在 PCR擴增的指數期。

一般來(lái)說(shuō)，每臺儀器在使用前都已經(jīng)設置好了熒光閾值。

CT值表示每個(gè)PCR反應管內熒光信號到達設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數。模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數越多，CT值越小，反之亦然。

利用已知起始拷貝數的標準品可作出標難曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數�？v坐標代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數。

可以從以下4個(gè)方面評估：

⑴ 曲線(xiàn)拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數期明顯，擴增曲線(xiàn)整體平行性好。

⑵ 曲線(xiàn)指數期斜率與擴增效率成正比，斜率越大擴增效率越高。

⑶ 標準的基線(xiàn)平直或略微下降，無(wú)明顯的上揚趨勢。

⑷ 各管的擴增曲線(xiàn)平行性好，表明各反應管的擴增效率相近。

對PCR產(chǎn)物加熱，隨著(zhù)溫度的升高，雙鏈擴增產(chǎn)物逐漸解鏈，DNA雙鏈逐漸解鏈為單鏈，嵌入到雙鏈中的熒光染料分子也會(huì )逐漸脫落下來(lái)，熒光信號強度逐漸下降。

在某段溫度時(shí)，雙鏈迅速而大量地解鏈，熒光信號強度驟然下降，在這段溫度中，一半的雙鏈解鏈的溫度我們稱(chēng)為熔解溫度（即Tm值）。

最終DNA雙鏈完全解鏈為單鏈，熒光值下降為一個(gè)本底水平。這一整體過(guò)程中的熒光信號隨溫度變化的曲線(xiàn)就是熔解曲線(xiàn)，稱(chēng)為原始圖譜。該圖譜做負導數換算后得到熔解曲線(xiàn)的導數圖譜，導數圖譜會(huì )出現熔解峰，熔解峰對應的溫度就是Tm值。

⑴ 如果在80℃-90℃之間出現唯一主峰，說(shuō)明熒光定量PCR完美；

⑵ 如果在80℃-90℃之間出現主峰，80℃以下出現雜峰，基本考慮引物二聚體，可嘗試提高退火溫度解決；

⑶ 如果在80℃-90℃之間出現主峰，溫度上升又出現雜峰，基本上考慮有DNA污染，需要在實(shí)驗初始階段去除DNA。

將標準品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的CT值作為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。

對未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據未知樣本的CT值，即可在標準曲線(xiàn)中得到樣品的拷貝數。標準曲線(xiàn)在絕對定量的時(shí)候非常重要。